Nature：暴露于淋巴中的转移黑色素瘤细胞免遭铁死亡的命运
年7月美国德州大学西南医学中心儿童研究所ThomasP.MathewsSeanJ.Morrison教授于Nature上发表文章，题目为Lymphprotectsmetastasizingmelanomacellsfromferroptosis，其证明淋巴结产生的黑色素瘤细胞比皮下肿瘤产生的黑色素瘤细胞更能抵抗运铁作用，在静脉注射后形成更多的转移。暴露在淋巴环境中可以保护黑素瘤细胞免受铁蛋白作用，并在随后的血液转移中增强其生存能力。
黑色素瘤和上皮癌通常在形成远处转移之前先在引流淋巴结中形成转移。对人类和小鼠癌症(包括黑素瘤)的基因研究表明，局部淋巴结转移有时会导致远处转移。与此相一致的是，淋巴结中的癌细胞可以移入血管，然后通过血液转移。尽管如此，一些远处的转移发生在与取样淋巴结中不同的克隆上。在这些病例中，尚不清楚远处转移的细胞是直接从原发肿瘤进入血液，还是在进入血液前先通过淋巴系统迁移。在皮肤黑色素瘤患者中，区域淋巴结转移是远处转移和死亡最重要的预测因子之一。完全的淋巴结清扫不能改善存活率，;然而，这并不一定意味着远处的转移是独立于淋巴系统发生的，因为来自淋巴结的黑色素瘤细胞经常会在发现区域转移之前进入血液并扩散。越来越多的证据表明淋巴系统促进癌细胞的迁移和存活。一些癌细胞在淋巴结内注射(鼻内注射)后比静脉注射后更容易形成肿瘤。血管内皮生长因子C(VEGF-C)和各种趋化因子促进癌细胞向淋巴管转移。代谢脂肪酸的能力促进淋巴系统癌细胞的存活和转移性肿瘤的形成。然而，循环中的癌细胞主要存在于血液中，关于这些细胞与淋巴管中的癌细胞相比如何，作者知之甚少。虽然有些癌细胞在进入血液前会通过淋巴管迁移，形成远处转移，但暴露在淋巴液中是否会影响这些细胞在血液中的后续存活尚不清楚。
血液转移是一个效率非常低的过程，几乎没有癌细胞能够存活。限制存活的一个因素是氧化压力;然而，氧化应激如何杀死转移细胞尚不清楚。脂质氧化可诱导铁氧化-磷脂中的多不饱和脂肪酸被氧化还原活性铁氧化的细胞死亡模式。虽然癌细胞在活体中可以发生铁死亡，但大多数铁死亡的研究都是在培养液中进行的，这限制了作者的理解体内铁蛋白作用影响癌症生长或进展的环境。
转移黑色素瘤细胞增加了淋巴结黑色素瘤细胞的存活。
图1：淋巴结中的黑素瘤细胞比血液中的黑素瘤细胞经历更少的氧化应激。
在人类(图1a)和小鼠(图1b)的黑色素瘤中，每微升肿瘤引流淋巴液中的黑色素瘤细胞明显多于肿瘤引流血液中的黑色素瘤细胞。通常能够在心脏穿刺获得的血液中检测到人体和小鼠的循环黑色素瘤细胞，尽管它们的频率比排瘤血液中要低。作者很少能在对侧淋巴中发现黑色素瘤细胞。因此，引流淋巴的黑色素瘤细胞明显多于引流血液的黑色素瘤细胞(图1a,b)。作者还在引流肿瘤的淋巴管中发现了转移无效的黑色素瘤细胞，但很少在血液中发现。这增加了黑素瘤细胞在淋巴中比在血液中存活更好的可能性。
作者测试了黑素瘤细胞在淋巴中的氧化应激是否比在血液中更少。将人和小鼠黑色素瘤细胞皮下移植到NSG或C57BL小鼠中，并让其自行转移。同样小鼠的皮下肿瘤、淋巴和血液中的黑色素瘤细胞用CellROXDeepRed染色，检测活性氧(ROS)，包括羟基自由基。对于免疫缺陷小鼠的患者源性异种移植物(图1c)和免疫功能小鼠的黑色素瘤(图1d)，黑色素瘤细胞在血液中的ROS水平始终显著高于皮下肿瘤和淋巴。分离后用还原剂2-巯基乙醇处理细胞，很大程度上挽救了ROS水平的增加。因此，黑素瘤细胞向血液中扩散与ROS显著增加相关，而向淋巴中扩散则不相关(图1c、d)。
人和小鼠血液中的黑素瘤细胞往往表现出谷胱甘肽比显著降低
氧化谷胱甘肽(GSH/GSSG)比黑色素瘤细胞从皮下肿瘤或淋巴。GSH/GSSG比值在淋巴癌和皮下肿瘤的黑色素瘤细胞之间没有显著差异。与此一致的是，作者观察到淋巴液中GSH浓度(图1g,h)和GSH/GSSG比值(图1i)明显高于血浆。淋巴液中8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-OHdG)氧化产物的浓度也较低(图1j)。因此，血液似乎比淋巴具有更多的氧化环境，这可能解释了血液中黑色素瘤细胞中ROS水平的增加。血液中氧化环境更强的原因尚不清楚，但可能反映了血液中比淋巴含氧量更高，或细胞组成或密度的差异。
图2：与淋巴液相比，黑素瘤细胞血液中铁蛋白含量增加。
人黑素瘤和小鼠黑素瘤分别皮下移植到NSG和C57BL小鼠，并使其自发转移。然后用BODIPY-C11流式细胞仪染色比较黑素瘤细胞中脂质ROS的水平。对于大多数人(图2a)和小鼠(图2b)黑素瘤，血液中的细胞表现出明显高于皮下肿瘤或淋巴细胞的脂质ROS水平。为了检验作者研究的黑素瘤是否会发生铁下垂，作者用erastin或萘普生汀-1培养它们。erastin通过抑制胱氨酸摄取来促进铁下垂，而萘普生汀-1通过减少脂质过氧化物的积累来抑制铁下垂。与对照培养相比，Erastin显著减少了细胞数量，而萘普斯汀-1阻断了这一效应(图2c,d)。铁促进脂质ROS的生成，是铁运所必需的。作者观察到血浆中游离铁的浓度比淋巴液中高得多(图2e)。铁螯合剂去铁胺的处理阻断了erastin消耗培养的黑色素瘤细胞的能力，这与铁蛋白作用一致。
为了确定铁死亡是否限制了皮下肿瘤的生长，作者分别将人黑色素瘤细胞和小鼠黑色素瘤细胞皮下移植到NSG和C57BL小鼠中。一旦发现肿瘤，每天给小鼠腹腔注射萘普生汀-1或赋形剂。萘普生汀-1对大多数黑色素瘤的皮下生长几乎没有或没有影响，根据先前的报道，铁蛋白作用并不限制已形成的皮下肿瘤的生长，这与这些肿瘤中缺乏氧化应激是一致的。为了确定铁死亡是否限制了血液中黑色素瘤细胞的存活，黑色素瘤细胞被用对照或萘普生汀-1预处理并静脉移植到小鼠体内。相对于溶媒预处理，萘普生汀-1预处理显著增加了转移性疾病负担，最有效的转移人类(图2f)和小鼠(图2g)黑色素瘤。因此，血液中有效转移的黑素瘤的生存期似乎受到了铁死亡的限制，但其他机制可能有助于降低低效转移瘤的转移，这与最近的一项研究一致。
为了测试铁蛋白作用是否限制淋巴内黑色素瘤细胞的存活，黑色素瘤细胞处理并移植到小鼠的淋巴结内。在人(图2h)或小鼠(图2i)黑素瘤经鼻内注射后，用萘普生汀-1预处理对转移性疾病负担没有显著影响。这表明，淋巴黑色素瘤细胞的存活不受铁蛋白作用的限制。抗氧化剂n-乙酰-l-半胱氨酸或Trolox(维生素E类似物)对小鼠黑色素瘤细胞的预处理也显著增加了静脉注射后的转移性疾病负担(图2j)，但不增加鼻内注射(图2k)。在静脉注射细胞之前，作者还使用自噬(3-甲基ladenine，一种磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂)、凋亡(VAD-FMK，一种泛caspase抑制剂)或坏死(GSK，一种受体相互作用蛋白(RIP)激酶抑制剂)抑制剂对小鼠黑色素瘤进行预处理。这些治疗对转移性疾病负担没有显著影响。
图3：油酸水平在淋巴液和来自淋巴液的黑色素瘤细胞中较高，油酸保护免受铁蛋白作用
为了更好地了解黑素瘤细胞在血液中而不在淋巴中发生铁蛋白作用的原因，作者将黑素瘤皮下移植，让它们自发转移，然后使用流式细胞术从同一小鼠的血液和淋巴中分离细胞进行代谢组学分析。主成分分析显示，来自淋巴的黑色素瘤细胞与来自血液的黑色素瘤细胞分别聚集在一起(图3a)。来自淋巴和血液的黑色素瘤细胞与来自不同患者的黑色素瘤细胞相比差别更大。作者对淋巴和血液中黑色素瘤细胞之间不同的代谢物进行了途径富集分析。前5个通路中有3个与脂质代谢相关(图3b)。磷脂的脂肪酸组成影响培养的癌细胞对铁蛋白的敏感性。在作者检测到的57种脂类中，黑色素瘤细胞在淋巴和血液中的脂类差异最大的是油酸。油酸在淋巴和血液中富集。
油酸是一种单不饱和脂肪酸，它通过减少膜内可氧化的多不饱和脂肪酸的数量或密度来抑制培养物中的铁蛋白作用。作者用油酸或亚油酸(一种多不饱和脂肪酸)处理小鼠和人类黑色素瘤细胞12小时，然后用erastin处理24小时，并计数活细胞。油酸或亚油酸本身对细胞数量影响不大，而伊拉斯丁却能显著降低人(图3c)和小鼠(图3d)黑色素瘤的细胞数量。油酸而不是亚油酸可以保护细胞免受伊拉斯丁的伤害，这表明油酸可以保护黑素瘤细胞免受铁蛋白作用。为了验证油酸是否能促进转移过程中黑色素瘤细胞的存活，作者在培养液中对黑色素瘤细胞进行了预处理，分别用油酸、亚油酸或载体培养12小时，然后静脉注射相同数量的活细胞给小鼠。在三种人类黑色素瘤中，有两种和两种小鼠的黑色素瘤中，作者观察到油酸处理细胞的小鼠的转移负荷明显高于载体或亚油酸处理细胞(图3e)。油酸预处理促进了大多数黑素瘤通过血液转移期间的生存能力。作者对37种血浆中最丰富的脂质进行了靶向脂质体分析。在作者分析的种脂质中，有37种在淋巴液和血浆之间存在显著差异。这些数据包括15个在淋巴中更丰富的三酰基甘油和22个在血浆中更丰富的磷脂。游离油酸的水平极低，在淋巴液和血浆中没有显著差异。然而,总甘油三酯、磷脂的油酸含量高出1.9-0.3倍，在NSG小鼠淋巴与血液和1.6C57BL小鼠高0.3倍(图3gh)。大多数循环三酰基甘油包含在ApoB阳性(ApoB+)小泡中，其中包括乳糜微粒。
为了测试ApoB+囊泡中是否发现含油酸三酰基甘油，作者从小鼠体内获得血浆或淋巴液，并通过磁选择分离出ApoB+囊泡。几乎所有的三酰基甘油和油酸都包含在ApoB+中，而不是ApoB部分中。与血浆中ApoB+部分相比，淋巴中ApoB+部分中油酸含量更高。因此，淋巴中油酸含量为主要在ApoB+小泡中的三酰基甘油中，这与大多数循环中的脂质是由这些小泡运输的观察结果一致。为了确定油酸在黑素瘤细胞中的保护作用是否需要膜结合，作者测试了这是否需要酰基辅酶a合成酶长链家族成员3(ACSL3)。ACSL3将脂肪酸转化为脂肪酸酰基辅酶a酯，并与膜磷脂结合，保护细胞在培养过程中免受铁蛋白作用。
黑素瘤中ACSL3的高表达，而不是ACSL4，与患者较差的总生存相关。ACSL3在大多数人类和小鼠黑色素瘤中都有表达，包括所有有效转移瘤。低效转移瘤有时表达很少ACSL3，这可能表明它们对油酸的影响不太敏感。作者使用CRISPRCas9从两个小鼠黑色素瘤中删除Acsl3。Acsl3删除显著降低油酸为磷脂的合并,这被过度的野生型Ascl3救起,但不是一个突变的Acsl3版本编码酶催化地死。Acsl3删除显著增加的脂质ROS水平皮下肿瘤,但没有显著影响扩散或生存文化。为了检测是否需要ACSL3来保护细胞不受铁亡作用，作者用油酸处理ACSL3缺失或亲本黑素瘤12h，然后用erastin处理24h，计数活细胞。油酸阻塞erastin在家长控制细胞的影响(图3d),但不保护细胞缺乏Acsl3erastin(图3i,j)。油酸的保护作用是恢复野生型的超表达但不突变Acsl3。油酸从而阻止ACSL3-依赖地erastin对黑色素瘤细胞的影响。与亲本对照细胞相比，鼻内注射acsl3缺失细胞可显著减少转移性疾病。作者还测试了SLC7A11(半胱氨酸和谷氨酸转运体)，ACSL4(酯化长链脂肪酸进行脂质生物合成)和铁作用抑制蛋白1(FSP1)的表达，每个都能影响铁作用敏感性。在作者研究的所有黑素瘤中，SLC7A11和ACSL4均在不同水平表达。FSP1在黑素瘤的一个子集中表达(例如，M和M)，但其他黑素瘤表达很少(UT10,YUMM1.7和YUMM3.3);通过逆转录定量PCR(qRTPCR)，作者观察到淋巴液和血液中黑色素瘤细胞中FSP1(也称为AIFM2)的转录本水平没有差异。黑素瘤中SLC7A11、ACSL4和FSP1表达水平的差异可能影响对铁死亡的敏感性。黑素瘤表达多种油酸转运蛋白，包括FATP1、FATP3、FATP4和FATP5(又称SLC27A1、SLC27A3、SLC27A4和SLC27A5)。FATP2保护髓细胞免受脂质ROS的影响，改变免疫功能和黑色素瘤的进展。另一种脂肪酸转运体CD36可以通过促进棕榈酸的吸收促进口腔癌的转移，尽管作者在研究的黑色素瘤中没有检测到CD36。
这些结果增加了淋巴结转移往往先于远处转移的可能性，因为暴露在淋巴结允许细胞转移，加入油酸和其他抗氧化剂，保护细胞在通过血液传播期间免受铁蛋白作用。为了验证这一点，作者从同一供体小鼠的原发性皮下肿瘤和淋巴结转移中分离出小鼠黑色素瘤细胞，并将其静脉移植到次级受体中。与来自皮下肿瘤的黑色素瘤细胞相比，来自淋巴结的黑色素瘤细胞更容易形成转移性肿瘤(图3k)。为了测试这种差异是否可逆或不可逆，作者将黑色素瘤细胞从原发性皮下肿瘤和淋巴结转移中分离出来，然后连续地将细胞先皮下移植，然后静脉移植。短暂的皮下生长消除了淋巴结来源细胞相对于表皮下肿瘤来源细胞的转移优势(图3k)。此外,黑色素瘤细胞的淋巴结转移通常是在文化抵抗erastin比细胞皮下肿瘤(图3l,m)。静脉注射实验表明癌细胞转移有可能通过血液,显然是独立于淋巴,但这是一个更有效的路线比通过淋巴转移。在作者研究的黑色素瘤中，大多数大多数油酸治疗后形成更多的转移。这表明，一些黑素瘤在淋巴中免受氧化应激的机制是独立于外源性油酸的，可能包括其他抗氧化剂水平的增加，内源性脂肪酸的产生或fsp1介导的机制。总的来说，淋巴似乎可以通过减少氧化应激来保护转移细胞，从而在随后通过血液的迁移过程中增加它们的存活率。
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