撰稿
Fu
审校
Fu
淋巴管系统在正常和病理情况下都起着至关重要的作用。它对于维持体液稳态、免疫反应和脂质吸收是必需的，并可被肿瘤转移所利用。大约一个世纪以前，人们提出了两种描述淋巴管系统起源的模型。第一种模型由Sabin提出，主张淋巴管内皮细胞起源于静脉；而第二种模型则由HuntingtonMcClure提出，认为淋巴管由不连续且独立的淋巴囊泡(lymphvesicles)融合形成，并且间充质来源的细胞贡献给淋巴管壁。在过去十年的斑马鱼活体成像和小鼠谱系追踪实验都支持了Sabin的猜想。然而，在非洲爪蟾的蝌蚪和鸡胚中却发现了间充质成淋巴管细胞来源的淋巴管。因而到目前为止，淋巴管内皮细胞的胚胎起源仍有争议。1-6在过去几年，特异性标记(specificmarkers)淋巴管内皮细胞的分子被鉴定出来，这为了解调控淋巴管特化(specification)和生长(growth)的机制提供了新的视角。淋巴管网络的组装是一个循序渐进的过程。在小鼠中，大约从胚胎第9.5天(E9.5)开始在主静脉(CV)内的部分内皮细胞亚群中检测到Prox1，另外两个转录因子Sox18和Nr2f2(COUPTFII)对诱导Prox1的表达是必需的。随后，新特化的淋巴管祖细胞响应VEGFC信号从CV中出芽并形成淋巴囊，最后形成机体的整个淋巴管系统。而问题就在于为何在CV中只有小部分细胞向着淋巴管命运起始特化，而其他细胞依然维持静脉细胞的身份？这仍是一个亟待解决的问题。研究表明斑马鱼的淋巴管系统与其他脊椎动物的淋巴管有很多相似之处3,7。对受精后2-4天(2-4dpf)的斑马鱼胚胎进行活体成像，发现沿胚胎中线在约2dpf处形成的脊索旁侧细胞(parachordalcells,PACs)是之后的淋巴管系统组成部分，来自后主静脉(posteriorcardinalvein,PCV)；从约2.5dpf开始PACs向腹侧迁移生成主淋巴管——胸导管(thoracicduct,TD)。年5月20日发表在Nature杂志的文章Lymphaticvesselsarisefromspecializedangioblastswithinavenousniche，发现在斑马鱼中，淋巴管祖细胞起源于主静脉内(cardinalvein,CV)一个之前从未被鉴定的壁龛内特殊成血管细胞(angioblasts)，这些成血管细胞也生成动脉和静脉细胞。进一步地，确认了Wnt5b是一种新的淋巴管诱导信号，并且它还促进了人类胚胎干细胞的“成血管细胞向淋巴管内皮细胞”(angioblast-to-lymphatic)的转变(transition)，表明这一过程在进化上是保守的。这一发现揭示了新的淋巴管特化机制，并且第一次描述了淋巴管诱导的微环境。更广泛的来说，这一研究表明了主静脉作为一种异质性结构，类似于主动脉壁龛的造血生态位。首先，研究人员通过Tg(fli1:EGFP)和Tg(fli1:nEGFP)转基因系活体成像脉管系统，以及通过Kaede蛋白的光转换(photoconversion)展示了淋巴管祖细胞起源于后主静脉(PCV)的腹侧(ventral),而非PCV的背侧(dorsal)。(Figure1)Figure1
淋巴管前体细胞起源于vPCV
有研究指出淋巴管内皮(LEC)前体细胞从PCV出芽(budding)大概持续24小时8。但作者认为：细胞的连续流出最终会导致PCV细胞壁的破坏，除非LECs是由一群反复分裂的特化祖细胞生成的(acontinuousexitofcellswouldeventuallyresultindisruptionofthePCVwall,unlessLECsarisefromapopulationofspecializedprogenitorsthatrepeatedlydivide).通过对Tg(fli1:gal4;uasKaede)胚胎进行延时序列拍摄，发现PCV的腹侧细胞(vPCV)进行了不对称分裂(asymmetricdivision)并且生成了贡献给新生PACs的子代细胞。随后研究人员通过定义细胞分裂是否非对称并且对PCV背腹侧的细胞分裂进行打分，进一步地证实了这一结果。令人意外的是，在追踪光转换的vPCV细胞时，发现这些细胞不仅生成PACs，而且向腹侧迁移并入肠上动脉(supraintestinalartery,SIA)和肠下静脉(subintestinalvein,SIV)。单细胞的Kaede光转换揭示了vPCV前体细胞特化的动态变化：在23hpf时大多数的这些细胞要么生成PACs,要么生成静脉节间血管；而在27hpf时会转向生成肠上动脉和肠下静脉。相反，在所有分析的发育阶段，PCV背侧细胞(dPCV)细胞主要生成静脉节间血管(venousintersegmentalvessels,ISVs)。总的来说，这些结果揭示了在PCV底部存在一种特殊的细胞，它们经不对称分裂，生成动脉、静脉和淋巴管内皮细胞命运。那么这些细胞是否代表直接起源于侧板中胚层(lateralplatemesoderm)并向PCV底部移殖的成血管细胞(angioblast)9？或者，这些细胞可能源自动脉，从背主动脉(dorsalaorta,DA)腹侧出芽到PCV的腹侧10。为回答这一问题,作者对17hpf时定植于DA的侧板中胚层内侧成血管细胞(lateralplatemesodermmedialangioblasts)，或可在19hpf时能在躯干检测到的侧板中胚层早期外侧成血管细胞(lateralplatemesodermearly-lateralangioblasts)进行泛-Kaede光转化，随后在48hpf对这些光转换细胞进行命运分析。发现生成PACs的vPCV细胞并非来源于DA,而是直接从侧板中胚层迁移到它们在vPCV的最终位置。这些结果证明vPCV细胞是一群特化的成血管细胞，它们直接起源于侧板中胚层并在发育的后期保留其多能性。为了进一步了解新鉴定的vPCV成血管细胞的分子特征，研究人员借助Tg(fli1:dsRed)[标记所有脉管系统]，Tg(flt1_9a_cFos:GFP)[标记动脉内皮细胞]，TgBAC(prox1a:KalT4-UAS:uncTagRFP)[在脉管系统中唯一特异标记淋巴管内皮细胞]转基因鱼系进行活体成像，追踪到flt1_9a:GFP阳性细胞以不对称的细胞分裂方式生成全部的PACs。这表明这一成血管细胞群是斑马鱼躯干中LECs的唯一起源。同样也表明了PCV是一种高度异质性的组织，包含能够产生多种“非静脉”命运的细胞，包括LECs。通过RNA测序成血管细胞的全基因表达谱，发现vPCV相对于dPCV细胞中明显富集已建立的成血管细胞、淋巴管和动脉标记基因。(Figure2)Figure2
vPCV细胞是特化的成血管细胞
最后，在确定了LECs的细胞来源后，研究人员分析了成血管细胞周围的组织以寻找相应的区域诱导因子。通过组织切片发现22-24hpf发育的vPCV细胞与内胚层紧密相邻，并且在sox32突变体(缺失内胚层来源的组织)中PACs发育缺陷。表明对LECs特化所必须的诱导因子来自内胚层。已有研究显示在脂肪形成和神经发生过程中Wnt/β-catenin信号通路能直接激活淋巴管特化所必须的转录因子Nr2f2和Prox1,因而作者就猜想内胚层分泌的Wnt(s)是否可能作为vPCV细胞向淋巴管内皮细胞LECs特化的诱导剂(inducer)。在执行了原位杂交检测，MO敲降，基因敲除和过表达实验后，确定了内胚层分泌的Wnt5b是胚胎发育过程中淋巴管形成的充要物质，但对vPCV成血管细胞的迁移和增殖却不是必需的；并且这一机制在进化上是保守的。(Figure3和4)
Figure3
wnt5b对于LECs的特化是充分必要的
Figure4Wnt5b诱导斑马鱼和人胚胎干细胞淋巴管的特化综上，该研究第一次在后主静脉底部发现一群特殊的成血管细胞，它们具有生成动脉、静脉和淋巴管命运的潜能。在解剖学角度上，这些细胞临近内胚层，在发育过程中内胚层细胞分泌Wnt5b，诱导成血管细胞向淋巴管内皮细胞特化。并且这一诱导机制在进化上是保守的。这些成血管细胞并非起源于背主动脉，而是直接从侧板中胚层迁移到后主静脉的腹壁，且保留了它们的“多潜能”能力。这一发现通过提供一种新机制帮助解决了一个世纪以来关于淋巴管内皮细胞起源的争论，使Sabin和HuntingtonMcClure提出的两种起源模型得到调和：一方面，淋巴管内皮细胞确实从静脉中出现;另一方面，它们却通过静脉壁龛内特殊的成血管细胞生成这一出人意料的机制发生。这些发现为疾病状态和再生过程中淋巴管的形成提出了一系列新的挑战。学习笔记：1.Prox1,amasterregulatoroflymphaticdifferentiationandmaintenance.2.Inplcg1-/-zebrafishmutants,whichlackarterialintersegmentalvessels(aISVs)aswellasbloodflow,butdevelopvenoussproutsandPACs.3.Celldivisionwasdefinedasasymmetricif(1)itgeneratedacellofdifferentfate,and(2)theplaneofdivisionwasperpendiculartothePCVmainaxis.WefoundasignificantlyhighernumberofasymmetricdivisionsinthevPCVat24–34hpf(initialstagesofLECspecification),withnochangesinsymmetricdivisionevents.4.Tg(flt1_9a_cFos:GFP),avegfr1(flt1)enhancer,whichspecificallylabelsarterialendothelialcells.5.Vegfc,asignalspecificallyrequiredforLECbuddingfromthePCV.6.Theexpressionofvegfcandccbe1remainedunchangedinsox32andwnt5bmorphants.7.Wnt5ismostlyreferredtoasanon-canonicalWntligand,whichcanalsorepressand/oractivatethecanonicalpathwayindifferentcontexts.8.Itiswell-establishedthatakeystepintheactivationofcanonicalWntpathwayistheinhibitionofadestruction
