综述猪肺异种移植的研究进展与发展方向

周明邓阳阳戴一凡蔡志明牟丽莎

摘要

肺移植是治疗终末期肺疾病的唯一有效方法，但一直面临着严重的供体短缺问题。用猪肺替代人肺移植到人体内有望解决供体肺短缺的问题。但由于猪肺对多种损伤如组织灌注损伤、抗体依赖的补体损伤、适应性免疫反应以及凝血功能障碍造成的损伤等高度敏感，故而猪肺异种移植亦面临着许多难题亟待解决。本文介绍了目前异种肺移植的国内外研究现状，并归纳总结了异种肺移植的研究模型及其优缺点，着重论述了异种肺移植的损伤机制及可能的解决方案，并探讨了异种肺移植的未来发展方向。

关键词:异种移植肺移植猪免疫排斥凝血失调基因敲除；CRISP/Cas9技术

肺移植是治疗终末期肺疾病的唯一有效方法，包括慢性阻塞性肺疾病、特发性肺纤维化、肺囊性纤维化、特发性肺动脉高压、肺结节病、肺淋巴管平滑肌瘤病等。随着手术技术的日渐成熟和免疫抑制的改进，肺移植在手术量、移植受者存活率等方面得到了长足的进步。根据国际心肺移植协会（InternationalSocietyforHeartandLungTransplantation，ISHLT）登记的数据，年度完成的肺移植手术已累计达例，仅年度例。然而，我国的肺移植全年仅例，与我国庞大的人口基数不成比例[1]。

供体肺的严重短缺限制了肺移植的进一步发展，我国肺移植手术量有限亦充分说明大部分患者无供肺可用。再者，由于肺的体表面积比较大，在膨胀状态时非常脆弱，使得肺在摘取和移植过程中易受损伤，导致肺移植的成功率在所有器官移植中相对较低。由于猪器官与人器官大小相近、来源不受限制，将猪肺替代人供肺移植给患者是一种很好的选择，可有效缓解供体短缺问题，且通过基因修饰已有效降低猪供肺的免疫原性。目前，国内外顶尖科学家及其团队正致力于猪肺异种移植的研究，并取得了一系列突破性的进展。

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异种肺移植的研究模型

与临床供肺受者最接近的动物模型是非人灵长类动物，如狒狒。通常情况下，异种移植模型是将猪的左单肺移植到狒狒的相应部位。根据ISHLT相关资料，当上述移植肺可维持受体生命至少3个月，且结果可重复实现时，该异种肺移植即可用于人体试验[2]。目前，将猪肺移植到狒狒体内，其存活时间的最长记录仅为5~8d[3-4]。因此，尽管该模型是异种肺移植的经典模型，但由于该模型实验花费大、有一定的伦理限制、受体存活时间短，故而不适合大规模的基础性研究。

利用新鲜的人血液在离体的生物反应器中对猪肺进行灌注，一方面恒温血流通过蠕动泵流入肺脏，另一方面供风设备规律地对肺脏供气以模拟呼吸，如图1所示。该模型能够很好地重现猪肺异种移植到非人灵长类动物体内时的动力学、生理学以及免疫组织学等的变化过程，可用于观察人类血液与猪血管内皮细胞接触后的一系列变化，对异种移植后发生急性排斥反应的机制作进一步研究。除了简单易行外，离体血液灌注模型的另一大优点是可进行独立、平行的实验研究，即利用该系统可以对猪的右肺和左肺进行独立的通气和灌注，从而为各种实验提供了适合的实验组（药物处理组）和对照组（未处理组），可用于观察干预措施的短期效应（6~8h）[5]。因此，该系统可用于评估血液灌注、药物处理以及移植前供体肺定向疗法的效果。

为了研究人的血液成份对猪血管内皮细胞的影响，科学家们开发出了模拟血液-内皮细胞相互作用的界面平台，如Bioflux?系统（美国FluxionBiosciences公司）。该系统利用人全血或血液中的某种成份灌注铺有猪内皮细胞的微流体通道，通过可视化方法（如连续荧光成像）可实时观察血液细胞粘附和血栓形成[6]，使得微血管功能失调以及血栓形成清晰可见。该模型最大的优点是简单易行，但应用范围相对局限。

2

异种肺移植损伤的机制及其解决方案

根据体外、离体、体内异种肺移植实验结果，科学家们发现了多种异种肺移植的损伤机制，并制定了相应的保护供体猪肺不被排斥的策略。

2.1.1　抗体与补体人类血液中存在着抗细菌表面抗原的抗体（如IgM和IgG），其中最重要的抗体能与猪细胞表面表达的α-1，3-半乳糖（αGal）残基抗原结合，引发剧烈的补体激活和血栓形成，最终导致超急性排斥反应的发生和猪肺异种移植的失败[7]。而αGal抗原表位是在α-1，3-半乳糖基转移酶（α-1，3-galactosyltransferase,GGTA1）的作用下合成的，因此GGTA1基因敲除（α-1，3-galactosyltransferasegene-knockout，GTKO）小型猪能够克服非人灵长类对供体器官的超急性排斥反应。然而，在离体人血液灌注肺模型中，αGal的缺乏只能轻微地延长猪肺的平均生存时间和降低补体沉积[8]。GTKO猪肺异种移植仍然很容易失败，其主要原因可能与抗非Gal抗体有关[8]。猪血管内皮细胞上的N-羟乙酰神经氨酸（N-glycolylneuraminicacid，NeuGc）是另一个重要的异种抗体结合位点，由胞苷-磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶（cytidinemonophosphate-N-acetylneuraminicacidhydroxylase，CMAH）合成。进一步将CMAH基因敲除（CMAHgene-knockout，CMAHKO）后，人血液对CMAHKO+GTKO细胞的排斥反应明显减弱，CMAHKO+GTKO猪的肺功能维持和器官存活时间可以进一步延长[9]。另外，将人补体调节蛋白（human







































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